Aplicaciones de las técnicas de cultivo in Vitro
Micropropagación

Mantiene la identidad genética del material propagado sin introducir ninguna variabilidad genética
Propagación clonal rápida (floricultura, fruticultura, plantas medicinales, silvicultura)
Eliminación de virus (cultivo de meristemas) hibridación o fusión somática (fusión de protoplastos)
Bancos de germplasma
Semillas sintéticas (embriones somáticos recubiertos de gel de alginato que también encapsula nutrientes para el desarrollo del embrión)

Resistencia a insectos
Puede ser obtenida mediante la utilización de inhibidores de proteasas vegetales o a partir de toxinas bacterianas (Bacillus thuringiensis), o gen Bt
Como ejemplos de plantas resistentes a insectos están el maíz, batata y soja transgénicos

Tolerancia a herbicidas
Esta modalidad engloba a la mayor parte de las plantas transgénicas actuales
Ejemplos: maíz, eucalipto, soja, caña de azúcar
Un ejemplo cotidiano es la Soja Roundup Ready

Resistencia a virus
Las perspectivas son cada vez mayores a medida que aumentan los conocimientos acerca de fitovirus

Silenciamiento génico o protección mediada por ARN
Por medio de la tecnología del Agrobacterium tumefaciens o de la biolística y el cultivo de tejidos, es posible introducir en la planta genes de la cápside viral posibilitándose así la adquisición de resistencia por parte de la planta.

Alteración del color floral
Dentro del mercado de la floricultura se abren nuevas perspectivas con el clonado de genes asociados con la coloración de las flores.
También se abre la posibilidad de modificar la arquitectura de la planta y de las flores, las fragancias y la mayor durabilidad de las flores.

Obtención de nuevos productos y alteración de la calidad nutricional
La empresa Calgene produjo aceites ricos en ácido esteárico.

Se alteró la composición en hidratos de carbono con vistas a la producción de tubérculos de papa, aumento del contenido de almidón y reducción de amilosa

En el año 2000 se informó la obtención de arroz genéticamente modificado que produce beta- carotenos, precursor de la vitamina A

Ingeniería metabólica
Es posible alterar rutas metabólicas para  permitir que las plantas, o sus células, funcionen como bioreactores (reactores biológicos).

Es posible, de esta manera, la producción de sustancias de valor farmacológico, como por ejemplo, vacunas y biofármacos.

La manipulación del metabolismo secundario de vegetales, por medio de la transformación genética, promete ser una de las contribuciones más importantes de la ingeniería genética aplicada a la industria.

La sobre expresión constitutiva de genes involucrados en la ruta biosintética de metabolitos secundarios podrá aumentar significativamente la cantidad de compuestos útiles producidos en plantas.

Los avances en esta área permitirán aumentar las productividad de metabolitos secundarios obtenidos en cultivos in vitro con la consiguiente reducción de costos de producción o logrando la producción de nuevos compuestos

Ejemplos de metabolitos secundarios producidos por cultivos in vitro de células vegetales

Biotransformación

Se usan para realizar reacciones bioquímicas sencillas en las que no se necesita diferenciación ni crecimiento celular

Hidroxilación estereoespecífica en posición 12-b de la b- metil digoxina, glicósido cardiotónico, por células de Digitalis lanata

Diferencias más importantes en el cultivo de células microbianas, animales y vegetales

Molecular farming

Qué es?
El Molecular farming es la producción de proteínas de alto valor agregado en plantas.

Cómo se hace?
Se usa el mejoramiento genético para introducir y expresar genes que codifican para proteínas de alto

Por qué en plantas?
En las plantas las proteínas se pueden producir a muy bajos costos y en grandes cantidades. También son flexibles y pueden producir una gran variedad de proteínas

Transformación          
1 El disco de la hoja es sumergida en una suspensión bacteriana. LA bacteria "Trojan Horse" infecta los bordes de la hoja y en este proceso integra los genes que codifican para la proteína de interés en el genoma vegetal.

2 & 3 Después de la infección los discos se ubican en medio de selección para las células que portan el gen de la proteína y regeneran en plántulas. Luego de aproximadamente seis semanas en medio de selección, un gran número de plántulas que portan el gen de interés son visibles en los bordes.

se remueven las plántulas de los bordes de hojas y se colocan en cajas plásticas transparentes con medio de enraizamiento.

Las plántulas se colocan en macetas y crecen hasta producir semillas. Estas semillas pueden ser usadas para la producción en gran escala de proteínas de interés farmacéutico

Tráfico Proteico        
6   Luego de la traducción, la proteína se moverá a través del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi para su procesamiento, plegado y glicosilación..

Producción en campo             
7  Luego de la cosecha el tejido que acumula la proteína puede ser directamente consumido o la proteína puede ser extraída para un uso posterior.

Proteínas obtenidas por Molecular Farming

Reactivos de diagnóstico

Vacunas animales

Alimentos animales

Enzimas industriales

Pharmaceuticals para el hombre

Ventajas del Molecular Farming para la producción de proteínas de uso farmacéutico y enzimas industriales

Riesgos sanitarios reducidos de contaminación por patógenos

Pueden ser escalados a costos relativamente bajos

Son capaces de modificaciones postraslacionales proteicas

Requieren de infraestructuras limitadas (para cultivo, cosecha, almacenamiento y procesamiento del material vegetal)

No se requiere, en muchos casos, la purificación de la proteína (por ej. Procesamiento de alimentos, aditivos alimenticios, fermentaciones y vacunas orales)

Valor de mercado de los productos proteicos del molecular farming

La demanda del mercado de proteínas para la industria farmacéutica se incrementa

Las proteínas expresadas en plantas resultan al menos 10 veces más baratas que las expresadas en otros sistemas (por ej, microorganismos)

El costo de vacunas expresadas en plantas , anticuerpos o proteínas puede ser 100- 1000 veces menor

Ventajas de los vegetales como bioreactores

Las plantas son los productores más  eficientes de proteínas,son bioreactores escalables
presentan ventajas en cuanto a  costos.

Las células vegetales son similares a las humanas en cuanto a: Maquinaria para síntesis proteica,Pauta de lectura del código genético,Ensamble, plegamiento y secreción de proteínas complejas

Anticuerpos recombinantes en vegetales Plantibodies 

Los Anticuerpos producidos en plantas pueden ser utilizados en especialidades medicinales?

Los anticuerpos producidos en plantas son seguros y efectivos?

Los glicanos vegetales pueden ser inyectados?

Son para administración oral, inhalatoria o tópica?

Las regulaciones de FDA y USDA están evolucionando?

Etapas del proceso

Clonado y expresión de los genes de interés

Regeneración y selección de las plantas

Recuperación y purificación de la proteína

Caracterización del producto final

Introducción de genes  de anticuerpos en plantas

Transformación con Agrobacterium.

Microinyección de cDNA en núcleo antes de reimplantarlo en una célula anucleada (Stieger et al. 1991)

Expresión transiente en hojas (Schouten et al, 1996)

Métodos biolísticos

Comparación de Anticuerpos derivados de Plantas y Cultivos Animales

Secuencia Peptídica: idéntica  

Afinidad: idéntica 

Tipos de Anticuerpos: El sistema vegetal es más versátil

Pueden producir isotipos incluyendo IgA secretoras

Procesamiento Post-transduccional: diferente

núcleo de glicano idéntico, azúcar terminal  diferente

Antigenicidad & clearance:  aparentemente idénticos

Anticuerpos efectivos producidos en vegetales

Anti-Streptococcus mutans (Guy’s 13)

Previene caries dental  en humanos

Las sIgA 10X de plantas son más estables que IgG

Nature Medicine 1998

Anti-Herpes simplex virus (HSV8)

Previene la transmisión del herpes  vaginal

Probado en ratones con PAb’s de arroz y soja

Nature Biotechnology 1998

Aplicaciones de la Inmunomodulación

Estudiar la función de un antígeno o incluso de un epitope en las plantas

Modificar caracteres agronómicos

“Inmunizar” a la planta contra un determinado agente.

Inmunomodulación de blancos endógenos

Actividad de fitohormonas

ABA (scFv en ER de tabaco)

Giberellina (A 19/24 scFv en tabaco)

Inactivación de producto final en la ruta biosintética de una hormona (ABA)

Modulación de la actividad del receptor hormonal (scFv contra fitocromo)

Inhibición enzimática (DFR en Petunia hybrida)

Inmunización intra y extracelular

Tabaco que expresa anticuerpos contra la cubierta viral proteica de TMV

Nicotiana benthamiana que expresa anticuerpos contra el virus BNYVV

Tabaco que expresa scFv contra factores de infectividad de fitoplasmas y espiroplasmas

Tabaco resistente a nematodes (IgM contra Meloidogyne incognita)

Anticuerpos contra nematodes

Genes que codifican para enzimas blanco: p.ej celulasas las cuales han sido clonadas de M. incógnita así como de otros nematodes de este tipo. Estas enzimas desempeñan un papel fundamental en la migración hacia raíz y son un excelente punto de partida para la selección de anticuerpos .Se han generado también anticuerpos que bloquean el inicio del ciclo celular para evitar la inducción de las células de alimentación por el nematode.

Se han obtenido y caracterizado por su capacidad para inhibir sus blancos anticuerpos contra las proteínas de TSWV :N (importante para la replicación viral), G1/G2 (captación por thrips) y NSm (distribución en la planta).

Se han hallado motivos estabilizadores que aseguran un nivel de expresión significativo de los anticuerpos y sus fragmentos en el citosol de la célula vegetal.
 

Perspectivas

1. Regulación metabólica.

2. Plantas con resistencia a virus mediada por plantibodies

3. Reducción del uso de pesticidas: resistencia a pestes e insectos

4. Modulación de antígenos (DH4R)

5. Estudio del rol fisiológico de hormonas.

6. Remoción de polutantes de suelos (Ac contra tóxicos orgánicos, compuestos potencialmente carcinogénicos, herbicidas)

7. Remoción de polutantes de aguas ( inmovilización el Ac en soporte sólido)

8. “Biofarming”: producción de moléculas industriales o farmacéuticas basada en cultivos vegetales. (1% TSP: expresión costo-efectiva). Análisis de especie, órgano.

9. diagnóstico

Downstream processing

Importante para utilización ex planta

Alcaloides y otras sustancias tóxicas encarecen y dificultan la purificación (tabaco)

Ausencia de virus patógenos, priones y otras sustancias típicas de sistemas de producción animales.

Posibilidad de usar un tejido vegetal comestible para inmunidad a nivel de mucosas (purificación)

Cuál es el desafío?

Desarrollo de drogas para el tratamiento de ciertas enfermedades; las proteínas son la clase en más franco desarrollo para la prevención y tratamiento de enfermedades.

Desarrollo de resistencia contra patógenos (microorganismos y patógenos más complejos como nematodes)

Análisis y manipulación de rutas biosintéticas.

Seguridad y Eficiencia

Ética

Extraído de Cultivo in Vitro de vegetales por la

Dra María Alejandra Alvarez

CULTIVO IN VITRO

Multiplicación de las Mejores Plantas

Esta  técnica brinda innumerables ventajas a la agricultura tales como

La sanidad de las plantas
La micropropagación de especies  de interés agrícola
La conservación de material vegetal.

Entre las diversas aplicaciones  del cultivo “in vitro”  en la agricultura pueden mencionarse la obtención de plantas libres  de patógenos (bacterias, virus), la micropropagación de especies  o variedades  de interés agrícola y la conservación de material vegetal.

En las especies  que se multiplican vegetativamente  la presencia de patógenos  puede estar latente, es decir los síntomas  no se detectan fácilmente  pero el rendimiento y la calidad van disminuyendo  en las sucesivas generaciones; en otros casos el patógeno es muy virulento provocando deterioros rápido e intensos en la producción. En el caso particular  de los virus,  su difícil detección y la carencia de métodos  químicos  para su control constituyen  serios inconvenientes.

Por todo esto surge la necesidad  de llevar a cabo programas  se saneamiento  para proveer material vegetal  de sanidad controlada  que asegure al productor un buen rendimiento en sus cultivos. Estos programas pueden efectuarse  bajo distintas  modalidades, y el cultivo “in vitro” es una de ella.  

La porción vegetal que se introduce  in vitro se denomina explanto. El explanto es un meristema  que definimos  como una porción  de la planta  en activa división celular. Estas porciones del vegetal que se utilizan como material de partida en programas de saneamiento se encuentran carentes de virus  o en una concentración muy baja.

La separación del meristema del resto de la planta  se efectúa con ayuda de lupa y utilizando pinzas  y bisturís  previamente esterilizados, luego se transporta  asépticamente al recipiente que contiene  el medio nutritivo esterilizado. Este medio de cultivo será el responsable del crecimiento de meristema y de la formación de nuevos brotes que se multiplicará.

Fuente: www.oni.escuelas.edu.ar